最近的两个项目压力真的太大了。
不是那种“今天任务很多”的压力，而是那种每往前走一步，前面又长出三条路，每条路都要验证、解释、画图、写清楚、还要经得起老师追问的压力。
我现在越来越觉得，读研最累的地方不是软件不会用，也不是代码跑不动，而是你以为自己已经找到一个结果了，结果老师一句话就能把它打回到上游：这个 peak 可靠吗？这个 overlap 严格吗？这个基因在人里面也上调吗？这个 enhancer 真的调控这个基因吗？这个 TF 真的能解释吗？这个 FitHiC2 是 top200K 吗？这个文献支持的是促衰还是保护？
然后我就会发现，所谓“找到一个候选基因”，根本不是找到一个名字而已，而是要给这个基因做一整套证据链。
我们现在做的是猪心脏衰老。最理想的故事是：找到一个转录因子，这个转录因子调控一个靶基因；这个靶基因在心脏衰老里有明确文献支持，最好能促进心脏肥大、纤维化、自噬异常、收缩功能下降或者其他衰老相关表型；同时，我们还要找到一个增强子，证明这个增强子可能调控这个基因。
听起来已经很复杂了，但这只是故事的开头。
首先，RNA 侧的证据要过关。这个转录因子和靶基因都必须在猪衰老阶段显著上调，而且最好是 FDR 显著，而不是只靠 P 值显著。logFC 还不能太小，表达比例也不能太低。也就是说，不能是那种 pct.1=0.05 的基因，哪怕统计上显著，生物学上也很难讲。至少要有一个比较像样的表达比例，比如 0.3 左右，才能让人相信这个基因真的在一部分细胞里有表达，而不是统计模型给出来的边缘结果。
但 RNA 只是第一层。
接下来还要看 ATAC。我们需要衰老阶段显著开放的 peak，而且这些 peak 里面要能富集到这个转录因子的 motif。也就是说，不仅这个 TF 自己要上调，它潜在能结合的区域也要在衰老阶段开放。否则就很难说它在衰老过程中真的参与调控。
然后还要看 SCENIC+。这个转录因子最好在 SCENIC+ 里面是一个 ++ 的 eRegulon，并且这个 eRegulon 要显著富集于衰老阶段。更关键的是，这个 eRegulon 里面必须包含我们的靶基因；调控关系还要是正相关，regulation 要是 1，importance 也不能太低。否则就只能说“这个 TF 可能相关”，但不能说“这个 TF 可能调控这个靶基因”。
到这里其实已经筛掉很多候选了。
随后还有跨物种证据。我们要把猪的显著差异开放 peak 通过 liftOver 转到人 hg38 上，然后和三套公共数据的人 ATAC 差异开放 peak 做 overlap。其中两套是单细胞 ATAC，一套是 bulk-ATAC。这里的 overlap 还不是“碰到一点就算”，而是老师更倾向于严格标准：两端都要覆盖 50% 以上，也就是猪的 peak 覆盖人的 peak 至少 50%，人的 peak 也覆盖猪的 peak 至少 50%。
这个标准非常狠。
任意 overlap 的时候，看起来还能剩下一些候选；一旦改成 50% reciprocal overlap，很多 peak 直接就没了。尤其是跨物种之后，坐标本来就会发生变化，peak 长度也不一样，再加上不同数据来源 peak calling 的边界不同，能严格 overlap 到的区域其实很少。
拿到这些 overlap peak 之后，还不能直接说它调控某个基因。我们还要把区域和基因连起来。
最直接的策略是看距离，比如这个区域离某个基因 TSS 在 20 kb、50 kb 或 100 kb 以内。距离越近越好，20 kb 以内最好讲，100 kb 就已经需要更谨慎了。
但老师又会问：距离近就一定调控吗？
所以我们还做了 bulk Hi-C / FitHiC2。希望能看到这个 enhancer 区域和目标基因的启动子或 TSS 区域之间存在显著互作，而且这个互作的 FDR 要显著。我们本来以为有 FitHiC2 显著互作就很不错了，结果老师又进一步要求：如果这个 interaction 不在 top200K 里面，那意义也不大。
我当时真的心态爆炸。
因为这意味着，不只是要有连接，还要是足够强、足够靠前、足够可信的连接。一个结果刚刚够到门槛，马上又会出现新的门槛。
有了这些被连接到的基因之后，还要继续过滤。这个基因必须满足：
- 是人猪同源基因，而且同源关系要高度可信，最好是一对一 ortholog；
- 在猪衰老阶段显著上调；
- 在人的衰老 RNA 数据里面，至少有一套也显著上调；
- 最好在不同数据来源之间方向一致，而不是猪上调、人不变，或者 ATAC old-open、RNA 不 old-up。
也就是说，我们不是只在猪里面找基因，而是要找到一个“猪里成立、人里也有支持”的衰老相关调控轴。
然后，对于这些满足条件的 overlap peak，还要单独做 AME。要求这些 peak 里面最好能富集到我们前面说的那个转录因子的 motif。这里又有一个问题：如果是单条 enhancer 做 AME，统计意义其实很弱，更像 motif scan，而不是严格的 motif enrichment。但汇报的时候又需要给出 motif 证据，所以只能非常谨慎地说：这是 motif presence 的线索，不是强富集结论。
随后还要看 Cicero。我们要求这个 overlap peak 和靶基因 TSS 之间有共可及性，也就是 co-accessibility 不能太低。最低可能要 0.2，严格一点甚至要 0.4。只有这样，才能说这个 enhancer 和这个 gene 在单细胞 ATAC 的开放状态上有一定联系。
但这还不是终点。
最后的最后，如果要把这个故事真正做成机制，就要进入实验验证：
- 靶基因敲除后，要能抑制衰老表型；
- 转录因子敲除后，要能抑制靶基因表达；
- 干扰这个增强子后，靶基因表达要下降，同时衰老表型要被抑制；
- 如果再恢复这个增强子、转录因子或靶基因，衰老表型最好还能被 rescue 回来。
也就是说，最终要证明的是一整条链：
衰老 → chromatin opening → enhancer activation → TF binding/regulation → target gene upregulation → aging phenotype。
而且这条链上的每一个箭头，都要有证据。
现在回头看，我觉得这个项目最折磨人的地方，是它不是一个单纯的生信分析。它更像是在给一个候选基因做全套“政审”。
RNA 要过关，ATAC 要过关，motif 要过关，SCENIC+ 要过关，跨物种 liftOver 要过关，人类公共数据 overlap 要过关，enhancer-gene link 要过关，FitHiC2 要过关，Cicero 要过关，文献机制要过关，最后实验还要能验证。
任何一环弱一点，这个候选就会变成“可以作为补充”，而不是“可以作为主线”。
更让人崩溃的是，很多时候不是结果完全没有，而是结果总差一点。比如：
这个基因猪里很强，但人里不显著。
这个 peak 任意 overlap 能碰上，但 50% reciprocal overlap 过不了。
这个 enhancer 离 TSS 不远，但 FitHiC2 不够靠前。
这个基因文献很强，但方向可能是保护性代偿，不一定是促衰。
这个 TF motif 有，但 eRegulon 里没有靶基因。
这个候选看起来很漂亮，但表达比例太低。
每一个“差一点”，都很消耗人。
以前我以为科研是找到一个有意思的现象，然后解释它。现在才发现，真正困难的是：你要不断证明这个现象不是偶然，不是噪音，不是批次，不是细胞类型混杂，不是坐标误差，不是数据库偏差，不是统计阈值放松之后才出现的结果。
有时候我真的会觉得，这不是在找基因，这是在审案子。
一个候选基因站在被告席上，我们要不断提交证据：表达证据、开放证据、motif 证据、调控证据、物种保守证据、文献证据、功能证据。老师就像法官，一条一条问：这个证据够强吗？有没有反例？有没有更严格的标准？有没有更直接的验证？
我知道老师严格是对的。因为如果证据链不够硬，后面做实验会更痛苦。一个不稳的候选，可能会浪费几个月甚至更久。现在多筛一点、多问一点，其实是在避免后面掉进更大的坑里。
但知道是一回事，压力又是另一回事。
当一个分析流程长到每一步都可能推翻前一步，当每一个结果都需要被重新解释，当你已经整理了很多图和表，下一秒又因为一个 top200K、一个 50% overlap、一个 FitHiC2 q 值被打回去的时候，真的会觉得很累。
读研好像就是这样：你不断以为自己快到终点了，然后发现前面还有一段路。而且这段路不是直的，是分叉的，每个分叉都写着“请补充证据”。
但我也不得不承认，正是这些折磨人的要求，让我逐渐知道什么叫“证据链”。
不是有差异就叫结果。
不是有 motif 就叫调控。
不是离得近就叫 enhancer-gene link。
不是 P 值显著就叫可靠。
不是一个物种成立就叫保守。
不是有文献提到就能直接套机制。
真正能讲出去的结果，必须经得起很多层追问。
所以现在虽然很崩溃，但我也能感觉到，自己确实比以前更知道怎么判断一个候选靠不靠谱了。只是这个成长过程真的太痛苦了。
如果以后有人问我，这个项目到底在做什么，我可能会说：
我们不是在找一个基因。
我们是在找一条能从猪衰老单细胞多组学，一直连到人类公共 ATAC/RNA 数据，再连到 enhancer、TF、靶基因和衰老表型的调控证据链。
如果这条链真的能闭合，那当然会很漂亮。
但在它闭合之前，每一个节点都足够让人怀疑人生。